Ezio se întoarce și luptă împotriva puternicului Ordin al Templierilor. Acum, în calitate de legendar Maestru Asasin, el trebuie să călătorească la Roma, centrul puterii, lăcomiei și corupției, pentru a lovi în inima inamicului. Ezio va conduce o întreagă Frăție, care se va aduna în jurul lui, și numai prin lucrul în echipă Asasinii pot învinge dușmanii lor mortali.

Assassin's Creed Brotherhood oferă, de asemenea, un element complet inovator de joc multiplayer, în care jucătorii vor putea să asiste Templierii, folosind Abstergo pentru a se antrena în arta asasinatului, pentru a elimina Asasinii odată pentru totdeauna. Jucătorii vor avea abilitatea de a alege dintr-o gamă de personaje unice - fiecare cu propriile lor arme și tehnici distincte de asasinat - și de a-și combina abilitățile împotriva altor jucători din întreaga lume în diferite moduri de joc.